直击中国白酒技术创新战略发展委员会：小麦源微生物在高温大曲制曲过程中的迁移规律和作用机制

中国白酒技术创新战略发展委员会第四期科研项目汇报（2023年）

课题名称：小麦源微生物在高温大曲制曲过程中的迁移规律和作用机制

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立项背景

“曲为酒之骨”，大曲作为白酒糖化发酵剂历史悠久，至今仍具有无法替代的作用。其制作过程通常采用开放式的自然接种形式，原料和环境微生物的参与形成了复杂独特的微生物群落，对于白酒独特风味和品质的形成具有重要意义。通过网罗原料和环境微生物的多菌种混合发酵是高温大曲制作过程的典型特征，以小麦为原料的固态基质既是微生物的营养源也是重要的生长微环境。目前，主要依靠经验控制的制曲工艺是制约大曲品质稳定性和生产标准化的主要问题。

原料是保证大曲微生物组形成和质量稳定性的关键因素。原料源微生物菌群在制曲过程中微生物组的组装和风味物质的形成至关重要。葡萄球菌是重要的芳香化合物生产者，乳酸菌产生的乳酸是乳酸乙酯形成的前体物质，芽孢杆菌是大曲中淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的重要贡献者。原料中的功能微生物能够驱动制曲过程中微生物群落的演替。通过构建关联网络观测优势小麦源微生物在大曲菌群中的生态位作用有利于制曲过程中功能微生物的筛选。制曲过程涉及到微生物富集、初级和次级代谢，富集的微生物进一步相互作用，形成平衡稳定的混合菌群，经过一系列复杂的演替过程，最终在白酒酿造过程中发挥作用。

近年来，研究人员采用多种方法，如利用传统培养法对可培养微生物进行分离纯化，利用分子生物学方法对不可培养微生物进行鉴定等对不同类型大曲的微生物多样性进行研究，得到了一些大曲微生物多样性以及微生物群落结构演替规律的结论。但原料源功能微生物在制曲过程中的迁移演变规律及其对大曲功能及品质特征的影响尚不清楚。基于此，本项目拟采用高通量测序技术和传统培养法追踪高温大曲制曲过程中微生物群落演替并挖掘发酵过程中的原料源功能微生物，进一步借助宏代谢组学技术分析制曲过程中的特征风味物质和非挥发性代谢物的变化，阐明原料源功能微生物在制曲过程中的迁移规律及其对大曲风味代谢功能的调控作用，基于菌系、物系和酶系多层面揭示原料源功能微生物在强化大曲中的应用潜力，为建立原料选用标准和提高大曲品质奠定理论基础，也为实现传统固态发酵工业化和标准化提供技术支持。

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主要研究内容

2.1 制曲过程中微生物群落组成分析

采集小麦和制曲过程中不同阶段的大曲样本，并对其微生物进行传统培养法和高通量测序结合分析。通过扩增子测序技术测定原料和大曲菌群结构，并进行对比和溯源分析，综合分析制曲过程中菌群和代谢功能的动态变化，明确制曲过程中微生物迁移规律。

2.2 制曲过程中的风味物质和代谢物变化分析

制曲过程中的大曲样本同时进行风味物质和非挥发性代谢物的分析，结合微生物分析结果进行关联网络分析，挖掘重要微生物的代谢特征，表征微生物与风味物质之间的关系，讨论微生物在制曲过程中的代谢功能，从更客观的角度阐明小麦源微生物对大曲菌群和风味物质的贡献。

2.3 小麦源功能微生物的筛选及其在强化大曲中的作用

结合已有对高温大曲中纯培养小麦源微生物功能的研究结果以及群落的结构分析结果，寻找对高温大曲群落贡献较大的微生物。测定菌株环境耐受性和产酶活性，筛选得到小麦源功能微生物。通过模拟大曲固态发酵体系，探索外源添加小麦源功能微生物对大曲微生物群落组成、代谢物谱和酿酒功能特性的影响，进而阐明小麦源微生物对于高温大曲的重要意义。

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研究结果

3.1 小麦和大曲中的可培养微生物计数

采集制曲原料小麦和制曲培菌第0、4、7、12、15、27、40天的过程曲样品进行可培养微生物计数，结果如图1-1所示。小麦携带着一定数量的细菌和真菌，参与到大曲微生物群落的初始组装，之后可培养微生物的数量呈现一定的波动变化，需氧菌落总数、耐热菌数、乳酸菌和真菌的数量均在培菌前4天有明显的上升趋势并在第4天达到峰值。刚入仓时曲块核心温度上升缓慢，湿度大，适宜微生物的生长，此阶段以培养霉菌和富集酶系为主。培菌第7天，进行第一次人工翻曲以调节不同位置曲块的温度和湿度相对均匀，此时可培养微生物数量有明显的下降趋势，之后温度又逐渐攀升，有利于耐热菌尤其是芽孢杆菌的生长繁殖，而霉菌的生长此后逐渐受到抑制，乳酸菌的耐热性也较差因此数量也有所减少。第40天培菌结束时，需氧菌落总数、耐热菌数、乳酸菌和真菌数量分别达到了7.56、6.62、4.50和4.60 log CFU/g。

图1-1 小麦和大曲中可培养微生物数量

注：Wheat，小麦样品；Mix_n，培菌第n天的大曲样品；Total aerobic bacteria，需氧菌落总数；Thermotolerant bacteria，耐热菌数；Lactic bacteria，乳酸菌，Fungi 真菌。不同字母标注代表具有显著性差异(Duncan检验，P < 0.05)

3.2 小麦和大曲微生物群落结构分析

在分析不同样品微生物多样性差异的基础上，进一步对小麦和大曲微生物群落结构进行探讨。首先通过Krona物种组成图将不同分类学水平小麦源细菌的组成进行可视化展示，如图2-1 (a)所示。小麦中细菌门水平以变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）为主，总占比超过80%，其中厚壁菌门主要以葡萄球菌属（Staphylococcus）为主。变形菌门中主要是泛菌属（Pantoea），假单胞菌属（Pseudomonas），博克氏菌属（Burkholderia）和马赛菌属（Massilia）。PacBio SMRT测序提高了微生物种水平的鉴定能力，在小麦中检出了相对丰度分别为15.00%的唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli），9.65%的金色马赛菌（Massilia aurea）和5.09%的松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）。唐菖蒲伯克霍尔德菌是一种植物病原菌，常常导致谷类等腐烂，目前关于其在大曲中的发酵特性还未明确，启示我们要密切关注一些植物病原菌，对原料质量严格把控，预防由植物病原菌引起的大曲品质下降。

小麦微生物的真菌结构如图2-1 (b)所示，子囊菌门（Ascomycota）丰度为64.34%，其次为担子菌门（Basidiomycota）(3.64%)。在属水平，链格孢属（Alternaria）和球腔菌属（Mycosphaerella）是丰度最优势的菌属，分别占比41.55%和17.12%，进一步种水平的鉴定结果表明链格孢属几乎全为Alternaria eichhorniae，而球腔菌属则均检出为Mycosphaerella tassiana。担子菌门中的真菌几乎全部为掷孢酵母属（Sporobolomyces）属的Sporobolomyces roseus。

图2-1 通过Krona可视化小麦源微生物群落结构

进一步，图2-2展示了更为详细的不同分类学水平细菌和真菌的组成情况。就细菌而言，厚壁菌门在整个培菌过程中均为丰度最优势的微生物，在培菌第4天时相对丰度达到最高，超过90%，随后呈波动下降趋势且丰度始终高于50%。变形菌门同样存在于培菌始末，相对丰度受温度影响较明显，波动较为剧烈。以上二者在小麦源细菌中总占比超过80%，说明小麦源细菌和培菌过程大曲的细菌轮廓具有一定相似性。在属水平，小麦源细菌和培菌初期大曲细菌组成较为相似，但与中后期过程曲菌群差异较大，尤其体现在高温放线菌属（Thermoactinomyces）和芽孢菌属（Bacillus）。对于真菌，小麦和大曲丰度最高的皆为子囊菌门（Ascomycota），子囊菌门在高温大曲培菌过程中优势明显，从第7天开始相对丰度保持在90%以上。在属水平，小麦为大曲发酵提供了丰富的链格孢属和一定丰度的曲霉菌属（Aspergillus），从培菌中期开始嗜热子囊菌属（Thermoascus）占据丰度优势并持续到培菌结束。

图2-2 小麦和大曲样品中不同分类学水平微生物的相对丰度(结果以组内均值展示)

注：柱状图展示了门水平细菌(a)和真菌(b)群落组成；Circos图展示了属水平细菌(c)和真菌(d)组成；气泡图展示了种水平细菌(e)和真菌(f)组成。

3.3 标志微生物的挖掘和微生物功能预测

使用ASV丰度表制作的韦恩图，展示了不同组间共有和特有的ASV个数如图3-1所示，无论是细菌还是真菌，都不存在所有样品共ASV，这说明培菌过程中菌群发生了剧烈的演替，小麦和培菌初始阶段大曲样品中的特有真菌ASV数目远多于中后期大曲样品。

图3-1 小麦和大曲中细菌(a)和真菌(b)韦恩图

在韦恩图的基础上，LEfSe分析直接对所有分类水平同时进行差异分析，强调寻找培菌过程中不同分组之间稳健的差异物种，即标志物种(biomarker)，且筛选在不同子分组中表现一致的差异微生物类群。这部分研究的目的更倾向于探寻培菌过程中的菌群演替规律和不同阶段的菌群特征，因此区别于上述韦恩图展示的结果。LEfSe分析所展示的物种分类学分枝图和LDA柱状图剔除了小麦样本，将研究对象集中于培菌过程的大曲。如图3-2所示，LEfSe分析结果包括两部分，分别为物种分类学分枝图，用以展示在各组样品中标志物种的分类学层次分布；显著差异物种LDA值分布柱状图，LDA分数表示不同样本之间的分化程度，柱形的长度为有显著差异的微生物类群线通过性回归分析得到的分值，用以展示每个样品内显著富集的物种及其重要性程度，设置LDA阈值为2，在不同组的细菌中共鉴定出3个差异类群(P < 0.05)，其中魏斯氏菌属（Weissella）在培菌第0天的样品中丰度显著高于其他组，可作为Mix_0的生物标志物。魏斯氏菌属和乳杆菌是大曲中检测出的典型乳酸菌类，能够以乳酸为底物进行酯化反应，酯化生成的乳酸乙酯与大曲的风味的形成有关，同时也是酸度增加的原因之一。真菌中共鉴定出11个差异类群，镰刀菌属（Fusarium）和掷孢酵母属是Mix_0中具有代表性的差异真菌属，而散囊菌目（Eurotiomycetes）在培菌第27天的大曲中相对丰度最高。培菌第0天的

大曲样品是指刚制作完成入仓的曲块，聚集了来源于原料和制作环境的微生物，未经高温筛选的菌群可能呈现出更为丰富的状态。

图3-2 基于LEfSe分析不同培菌阶段大曲微生物的生物标志物

注：细菌(a)和真菌(c)的物种分类学分枝图；细菌(b)和真菌(d)的显著差异物种LDA值分布柱状图(LDA > 2, P < 0.05)；分枝图中的空心节点代表组间差异不显著的分类单元，而其它颜色节点则表明这些分类单元体现出显著的组间差异，该分类单元最高等级的物种进行阴影处理。

在以上基础上，参照微生物基因组数据，对测序结果进行菌群基因和功能单元组成的预测，首先对各组中不同分类的细菌和真菌通路进行统计。细菌和真菌的功能通路主要集中在生物合成、物质的降解/利用/同化、前体代谢物和能量的产生。获得了样品分组的通路丰度后，进一步使用分层的样本代谢通路丰度表进行通路的细菌（图3-3）和真菌（图3-4）物种组成分析。本研究目的在于对小麦源微生物的功能进行预测和发掘，因此根据各代谢通路中小麦样品微生物的平均功能丰度和发酵过程中所有大曲样品组微生物的平均功能丰度的差异倍数进行筛选，得到了差异倍数较大且与培菌过程相关的通路说明小麦源菌属的潜在功能。

对于细菌，Pantoea在多粘菌素耐药性(PWY0-1338)、5’-磷酸吡哆醛生物合成(PYRIDOXSYN-PWY)、葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸降解(GLUCOSE1PMETAB-PWY)、ADP-甘油-β-D-甘露庚糖合成(PWY0-1241)和蔗糖降解(PWY-5384)途径中发挥更重要的作用，Pantoea在小麦和培菌初期的大曲中相对丰度更高，是小麦源功能微生物的重要代表之一参与大曲菌群组装。小麦携带的Pantoea可能来源于种植环境的水和土壤，研究指出其具有修复和降解农残和有毒物质的潜力，作为植物内生菌，还有固氮和促生的功能，从功能预测的角度，我们也发现了其具有葡萄糖和蔗糖降解的潜力，这些代谢功能与发酵过程密切相关，但泛菌属在多大程度参与这些代谢以及具体的代谢机理还有待深究[108]。从真菌的代谢通路物种组成来看，小麦源微生物在L-酪氨酸降解(TYRFUMCAT-PWY)、5-氨基咪唑核糖核苷酸生物合成(PWY-6121)、L-色氨酸降解为2-氨基-3-羧基粘多糖半醛(PWY-5651)、嘧啶核苷回收的超级途径(PWY-7196)、嘌呤核苷酸补救的超级途径(PWY66-409)和L-蛋氨酸生物合成III(HSERMETANA-PWY)中功能丰度优势明显，其中链格孢属和球腔菌属对5-氨基咪唑核糖核苷酸生物合成贡献最大，而掷孢酵母属与L-色氨酸降解有关。以上在分析了小麦中的标志微生物的基础上，进一步预测了小麦微生物突出的代谢功能，这有助于系统全面地了解小麦源微生物在培菌过程中的作用和发挥作用的机制。

图3-3 关键代谢途径的细菌群落组成

注：标签a、b、c、d和e展示了不同的代谢通路；

横坐标为样本分组标签；纵坐标为相关代谢通路的相对丰度；以不同颜色分层展示属水平下不同分类单元对该代谢通路的贡献值比例

图3-4关键代谢途径的真菌群落组成

3.4 制曲培菌过程中挥发性代谢物谱及差异分析

GC-IMS指纹图谱详细地展示了每个样品中物质的丰度和每种物质在不同样品中分布的差异如图4-1所示，a图的指纹图谱中，每一列代表一个样品中选取的全部信号峰，每一行代表同一挥发性物质在不同样品中的信号峰，颜色越亮代表物质相对含量越高，数字标签代表迁移谱库中未定性的物质。结果显示我们在小麦和大曲样品中共检测到81个信号峰，其中对比数据库共鉴定到29种化合物，其中一些VOCs同时以单体和二聚体的形式存在，保留时间相似，但漂移时间不同，形成不同信号。小麦和培菌第0天的大曲样品VOCs组成总体相似，区域A代表二者的特征化合物包括水芹烯、2-庚酮和己醛，水芹烯是一种重要的功能因子，是多种挥发性油中的天然成分，可作为香料，还可以作为生物活性杀虫剂，这对大曲风味的生成和预防虫害有一定的作用。培菌第4天时，一些物质包括3-辛醇、2-乙酰基-1-吡咯啉、苯甲醛、己酸乙酯、2-甲基-3-呋喃硫醇、2-甲基丁酸乙酯和乙偶姻等含量明显升高。如区域C所示，培菌的第7到15天是VOCs大量形成的关键时期，而第27天之后，区域C内的物质相对含量明显减少，3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和甲基丙醛成为培菌后期的代表性物质。PLS-DA图展示了有监督的样品聚类情况，说明不同阶段的大曲样品组之间有较明显的代谢物积累差异，基于此模型筛选出了15种VIP > 1的差异代谢物如c图所示。

图4-1 小麦和大曲中的挥发性代谢物谱

a：挥发性代谢物的指纹图谱；b：不同组样品中挥发性代谢物的PLS-DA分析；c：基于PLS-DA模型筛选差异代谢物(VIP > 1)

3.5大曲培菌过程中非挥发性代谢物谱及差异分析

为了更全面展示小麦和大曲中代谢物的积累，本项目通过1H NMR对水溶性小分子代谢物进行了测定，共检测到200多种物质，主要是糖类、氨基酸及其衍生物、酸类、醇类和酯类等，结果如图5-1所示。对所有测到的物质进行降维处理，以PLS-DA模型下VIP值>1筛选得到了42个组间差异明显的non-VOCs，包括6种糖类、9种酸类、16种氨基酸及其衍生物、7种醇类以及4种其他物质（图5-2）。如结果所示，磨碎的小麦样品中富含葡萄糖、甘露糖、核糖和果糖。葡萄糖含量在前4天增加了2倍以上，并在培菌初期保持在较高水平。小麦中果糖含量高于大曲样品，甘露糖含量在培菌过程中缓慢增加然后稍有下降，而核糖含量主要在培菌后期增加。小麦中的乳酸、甲酸、乙酸、柠檬酸、2-羟基戊二酸盐、葡糖二酸盐、琥珀酸盐和其它酸类较少。其中，乳酸含量在培菌初期明显增加，第12天积累最多。乙酸含量的变化趋势与乳酸相似。从培菌初期开始，乙酸的含量急剧增加，在第4天达到高峰，然后下降到一个较低的水平，并一直维持到末期。不同的是，甲酸、2-羟基戊二酸盐和琥珀酸盐的含量在前期较低，中后期较高。甘露醇和赤藓糖醇在培菌过程中呈现先上升后下降的趋势，峰值出现在第27天。木糖醇和D-苏糖醇含量在前4天增加，然后保持相对稳定。第4天丙二醇含量明显高于其他时间点，后期逐渐升高。乙醇含量在第12天至第15天展示出较高水平，但在早期和后期较低。小麦中O-磷酸丝氨酸的含量高于大曲样品中的含量。大曲富含脯氨酸、亮氨酸、焦谷氨酸和丝氨酸。异亮氨酸和丙氨酸含量变化不明显，而4-羧基谷氨酸含量波动较大。总之，几乎所有non-VOCs含量在培菌前4天都呈现急剧上升的趋势。大部分酸类、醇类和氨基酸类的含量在随后的过程中没有明显变化，而糖类尤其是还原糖的含量在中后期急剧下降。小麦经过微生物分解产生的糖类、氨基酸类和酸类等是高温大曲特征风味的前体物质。

图5-1通过1H NMR检测到的小麦和大曲中的物质组成

注：不同字母标注代表每种物质类别在不同组之间具有显著性差异(Duncan检验，P < 0.05)

图5-2 1H NMR鉴定出的小麦和大曲中的差异代谢物

注：通过PLS-DA筛选差异物质，显示了VIP > 1的糖类、酸类、氨基酸及其衍生物、醇类和其他物质

3.6 微生物和代谢物的相关性分析

进一步将细菌微生物组和代谢组进行相关性分析，可以更直观地预测并理解微生物与代谢物的相关性，如图6-1所示。葡萄球菌属（Staphylococcus）和泛菌属（Pantoea）与果糖产量呈正相关，与焦谷氨酸产量呈负相关，葡萄球菌属还与一些non-VOCs如苏糖酸盐和柠康酸盐呈负相关作用，而泛菌属与一些VOCs呈负相关，如1-辛烯-3-酮、2-甲基丁醛和苯乙醛。嗜热放线菌属（Thermoactinomyces）与果糖含量有负相关作用，对甘露醇、赤藓糖醇、琥珀酸、焦谷氨酸和柠康酸有正向促进作用，嗜热放线菌属可以分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、葡萄糖淀粉酶等水解蛋白质和淀粉，代谢产生VOCs[118]。糖多孢菌属（Saccharopolyspora）与一些VOCs包括1-辛烯-3-酮、2-甲基丁醛二聚体、3-甲基丁醛二聚体和苯乙醛单体之间存在正相关关系。整体来看，嗜热放线菌属和葡萄球菌属与大部分non-VOCs的相关性趋势相反，而泛菌属（Pantoea）和糖多孢菌属（Saccharopolyspora）与VOCs的相关性相反。

图6-1 Spearman秩相关检验的微生物与代谢物相关性热图

a：细菌和非挥发性有机物；b：细菌和挥发性有机化合物；c：真菌和非挥发性有机物；d：真菌和挥发性有机化合物。上述微生物为细菌/真菌相对丰度排名前10的菌属，代谢产物为通过PLS-DA模型筛选的组间有显著差异的挥发性物质和非挥发性物质(*表示P < 0.05；**表示P < 0.01)

对于真菌和代谢物相关性作用，热图结果显示嗜热子囊菌属（Thermoascus）与众多代谢物呈正相关作用，其中包括3种醇(甘露醇、赤藓糖醇和阿拉伯糖醇)、3种醛(2-甲基丁醛二聚体、3-甲基丁醛二聚体和苯乙醛单体)、3种酸(甲酸盐、葡萄糖酸盐和琥珀酸盐)和2种氨基酸衍生物(焦谷氨酸盐和谷氨酰胺)。Chromocleista与乳酸和亮氨酸呈强正相关作用(相关性系数绝对值大于0.8)，Alternaria和Mycosphaerella与一些氨基酸(脯氨酸和精氨酸)及其衍生物(焦谷氨酸和4-羧基谷氨酸)呈显著负相关，而与果糖含量呈正相关。图d可以看出Alternaria和Mycosphaerella与大多数差异性的VOCs展示出了相似的相关性作用，尤其是1-辛烯-3-酮单体、2-甲基-丁醛和3-甲基丁醛二聚体、甲基丙醛、苯乙醛单体和丙醛。Millerozyma被预测与葡萄糖、乳酸、乙酸、亮氨酸和缬氨酸呈正相关，Rhizomucor和Lichtheimia的丰度与乙酸盐呈正相关，Alternaria、Mycosphaerella和Aspergillus这三个真菌属与代谢产物的相关性趋势相似，而Thermoascus与它们的相关性趋势几乎相反。

细菌和真菌丰度优势菌属和代谢物的相关性分析表明高温放线菌属和葡萄球菌属与大多数非挥发性代谢物的相关性趋势相反，而泛菌属和糖多孢菌属与挥发性代谢物的相关性作用相反。链格孢菌属、小球壳菌属和曲霉菌属与代谢产物的相关性趋势相似，而嗜热子囊菌属与它们的相关性趋势几乎相反。以上关联网络分析全面展示了大曲培菌过程中多组学之间的关联性，为后续菌群的功能验证提供了思路和方向。

3.7模拟培菌解析小麦源菌群的代谢特征

本部分研究是在实验室水平下，模拟车间高温大曲的制曲培菌过程，设置相同的培菌温度，以是否将小麦源微生物进行灭菌处理为变量，比较对照组和实验组培菌过程中可培养微生物数量、群落演替、代谢物积累和代谢通路表达的差异，全面直观地阐述小麦源微生物在培菌过程中的功能作用，并筛选其中发挥最关键功能的小麦源核心菌属，发掘核心微生物的代谢功能，旨在从控制微生物的角度优选原料，调节和优化高温大曲培菌过程。

对两组模拟培菌的大曲样品的可培养微生物数量进行统计分析，结果显示，在模拟培菌初期，不做任何处理（MOE）组的需氧菌落总数显著高于灭酶灭菌（MOE_inactivate）组，耐热菌生物量也呈现了相似的趋势。从培菌第7天到结束，MOE和MOE_inactivate组中的可培养真菌数量都低于有效计数范围。在相同的培菌温度下，实验室水平的模拟培菌可以获得数量可观的可培养细菌，但真菌数量处于很低水平，因此我们认为小麦源细菌在培菌过程中可能起着更重要的作用，而真菌更可能来自制曲车间环境。综上，小麦源细菌应该得到更多重视。进一步对两个实验组的微生物组和代谢物进行解析和相关性分析，高通量测序结果表明两个培菌过程的细菌多样性和群落结构都有明显差异，MOE组细菌的多样性更高，群落组成更丰富，两组中丰度最高的细菌均为芽孢杆菌属。1H NMR结合多元统计分析筛选出的两组间的差异代谢物在MOE组中含量更高，尤其是糖类和氨基酸类，这些物质主要在培菌的前4天快速积累，小麦源细菌在温度驱动下参与了这一阶段菌群的剧烈演替和活跃的代谢活动。

在以上结果基础上，本研究继续从微生物多样性的角度探讨了两组培菌特征差异的原因。使用细菌序列丰度前100的ASV构建了系统发育树以分析细菌群落中的进化关系，，50%左右的ASV注释为Bacillus，且Bacillus在MOE_inactivate和MOE组的分布存在差异性。这一结果佐证了Bacillus的异质性是导致两组培菌微生物群落演替和代谢差异的关键因素。此外，结合培菌前期糖类和氨基酸类的快速积累这一特征，下一步以Bacillus菌属为关键研究对象，小麦源微生物参与的糖和氨基酸代谢为关键代谢过程进行更深入的讨论。

MOE_inactivate组和MOE组通过PLS-DA模型的VIP值筛选的差异代谢物的代谢通路富集和功能预测情况如图7-1所示，差异代谢物与氨酰tRNA生物合成，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸盐代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，氮代谢，半乳糖代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸盐代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，精氨酸生物合成等显著相关。根据通路的富集情况，氨基酸类和糖类相关的代谢对不同培菌组的培菌特征差异有重要影响，因此进一步详细展示了缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生物合成，半乳糖代谢，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解，精氨酸生物合成，淀粉和蔗糖代谢6条重要代谢途径如b图所示。代谢途径中的差异代谢产物包括氨基酸和糖分别用蓝色和红色字体标记，MOE组的L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、谷氨酰胺、D-甘露糖、α-D-葡萄糖-1P、D-葡萄糖含量均高于MOE_inactivate组，这些物质多在培菌早期快速积累。

在明确了差异菌属和差异代谢通路之后，本研究继续探索了Bacillus和糖代谢、氨基酸代谢之间的关联性。通过PICRUSt2预测了模拟培菌过程中Bacillus的基因组功能，选择所有注释到Bacillus的ASV进行糖和氨基酸代谢相关的功能预测，并通过微生物的功能丰度和差异倍数展示差异性（图7-2）。总体而言，培菌结束时MOE组Bacillus的糖和氨基酸代谢相关的代谢通路丰度高于MOE_inactivate组，涉及到的氨基酸代谢通路有14个，糖代谢通路有15个，其中差异倍数最大的通路分别是组氨酸代谢和磷酸肌醇代谢。

图7-1 高温大曲模拟培菌过程中代谢产物功能分析

a：代谢通路富集概况气泡图；b：关键的差异代谢途径和涉及到的差异代谢物(糖类和氨基酸类)

图7-2 Bacillus在MOE_inactivate和MOE培菌组中的功能预测

a：模拟培菌结束时Bacillus的糖代谢和氨基酸代谢的功能丰度；b：组氨酸和磷酸肌醇代谢相关的酶功能注释的相对丰度热图；c：酶注释的序列16S rRNA基因拷贝数的单因素方差分析比较，*代表P < 0.05

小麦源微生物影响高温大曲菌群的组装尤其在培菌早期阶段，提供了丰富的代谢物和风味前体物质调控群落演替，以前的研究已表明大曲中的细菌主要来源于原料，真菌来源于制曲环境。在本研究中，我们分别使用灭菌的小麦(MOE_inactivate)和未作处理的小麦(MOE)分别进行模拟培菌，同时检测培菌过程中两组微生物和代谢物谱的差异。可培养微生物计数结果表明小麦在培菌初期提供了更多细菌，随着培菌的进行，小麦源细菌发挥了更明显的作用，这和以前的结果一致。培菌过程中，Bacillus是两组中的丰度最高的优势细菌，通过构建系统发育树表明Bacillus的异质性是菌群差异性的集中体现。

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成果表达

4.1 已发表文章

ü Zhang Y D, Shen Y, Cheng W, Wang X, Xue Y S, Chen X X, Han B Z. Understanding the shifts of microbial community and metabolite profile from wheat to mature Daqu[J]. Frontiers in Microbiology, 2021, 12: 714726.

ü Zhang Y D, Xu J G, Ding F, Deng W Y, Wang X, Xue Y S, Chen X X, Han B Z. Multidimensional profiling indicates the shifts and functionality of wheat-origin microbiota during high-temperature Daqu incubation[J]. Food Research International, 2022, 156: 111191.6

ü Zhang Y D, Xu J G, Jiang Y L, Niu J, Chen X X, Han B Z. Microbial characteristics and metabolite profiles of high-temperature Daqu in different maturation stages[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2022, 38(12): 234.

ü Zhang Y D, Shen Y, Niu J, Ding F, Ren Y, Chen X X, Han B Z. Bacteria‐induced amino acid metabolism involved in appearance characteristics of high‐temperature Daqu[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2022, 103(1): 243-254.

ü Zhang Y D, Ding F, Shen Y, Cheng W, Xue Y S, Han B Z, Chen X X. Characteristics of the microbiota and metabolic profile of high-temperature Daqu with different grades. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2022, 38(8), 137.

ü 张原頔, 沈毅, 程伟, 薛岩松, 陈小雪, 韩北忠. 三代全长高通量测序分析新稻草和陈稻草的微生物特征[J]. 中国酿造, 2022, 41(09): 24-30.

ü 张原頔, 陈小雪, 吴鹏, 史利霞, 韩北忠. 多组学分析众麦1号和糯麦116两种制曲小麦的特征[J]. 中国酿造, 2023, 42(02): 32-39.

ü 丁芳, 张原頔, 蒋英丽, 陈波, 陈小雪, 韩北忠. 不同等级高温大曲微生物群落和代谢物的特征分析[J]. 中国酿造, 2022, 41(11): 24-30.

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行业效益与人才培养

目前白酒行业内普遍存在大曲品质不稳定的问题。已有研究表明制曲原料对大曲的品质有重要影响，小麦源微生物对高温大曲菌群有重要贡献，因此从原料微生物的角度着手，揭示原料微生物在发酵过程中的迁移规律和作用机制，有利于对大曲微生物菌群的形成进行干预，从而提高大曲品质，在此基础上，锚定制曲过程中的核心功能微生物菌群，用标准化的手段来规范传统工艺，保证白酒的产量和质量，也为固态发酵过程由“经验型”控制向“科技型”控制转变奠定了基础。

共培养博士研究生1名和硕士研究生2名。

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下一步研究计划

强化接种是验证功能菌株特性的有效手段，已有很多研究通过筛选菌株和强化接种来调节发酵系统中微生物群落的代谢活动，达到改良发酵产品的风味的目的。下一步研究的主要内容是分离、纯化和鉴定小麦源芽孢杆菌菌株，通过环境耐受性测试和产酶活力筛选发酵性能优良的部分进行强化接种实验，通过1H NMR、LC-MS和氨基酸分析仪检测了功能菌株单独培养时发酵液中和强化大曲样品中的糖和氨基酸物质的含量，表征功能菌株参与糖代谢和氨基酸代谢的特征，同时通过扩增子测序和生信分析展示了强化接种对大曲菌群的扰动作用，最后通过多组学联合分析阐明了菌株参与的关键代谢通路。